CRISPR兩大先驅合作,揭示單堿基編輯易脫靶的原因
2020年08月03日16:49

  來源: 學術經緯

  2012年,被喻為“上帝的手術刀”的CRISPR-Cas9系統橫空出世,短短的八年里,這種工具已經應用到包括醫藥、農業、基礎科研等諸多領域。以經典的CRISPR-Cas9為基礎,科學家們還開發出一系列工具,例如可以轉換單個核苷酸的堿基編輯器,以期治療單基因點突變導致的遺傳疾病。然而,這些先進的新技術並非完美,其可能的脫靶效應及潛在的安全隱患同樣十分引人關注。

  日前,基因編輯領域的兩位宗師級科學家Jennifer Doudna教授和劉如謙(David Liu)教授聯手,在《科學》雜誌上報導了一種堿基編輯器的首個詳細3D結構。“這一結構幫助我們從更深層次上理解堿基編輯器,”加州大學伯克利分校的Doudna教授說,“我們現在可以看清它是怎麼工作的,就可以製定明智的策略來改良這個系統。”

  Doudna教授與合作者在2012年發現,細菌中找到的CRISPR能用於基因組編輯。本質上看,CRISPR-Cas9是蛋白質和RNA的混合體,它們能夠精確地瞄準一段特定的DNA,然後像剪刀一樣剪開這段序列。

  此後,哈佛大學和麻省理工學院Broad研究所的劉如謙教授等人開發出了首款堿基編輯器,將經過修飾的Cas9(禁用了其DNA剪接功能)與另一種細菌蛋白(脫氨酶)結合,無需使DNA斷裂,就能定點修改基因中的單個堿基。這種堿基編輯器可以把DNA雙鏈上的腺嘌呤(A)-胸腺嘧啶(T)組合替換為鳥嘌呤(G)-胞嘧啶(C)組合。在人類遺傳疾病中,大約60%(超過15000種)的致病單堿基變異有望利用現有的堿基編輯器來糾正。

本研究的兩位通訊作者Jennifer Doudna教授和劉如謙教授(圖片來源:UC Berkely & Broad Institute [credit: Casey Atkins Photography])
本研究的兩位通訊作者Jennifer Doudna教授和劉如謙教授(圖片來源:UC Berkely & Broad Institute [credit: Casey Atkins Photography])

  研究人員在論文中指出,早期的腺嘌呤堿基編輯器(ABE)效率很低,但經過多次篩選,最新的版本ABE8e速度提高了約1100倍,能在15分鐘內完成幾乎100%的堿基編輯工作。

  但除了效率提升外,要將堿基編輯器應用到人類遺傳疾病的治療上,科學家們還迫切想要解決“脫靶效應”,也就是針對無關DNA片段的編輯。

圖片來源:123RF
圖片來源:123RF

  蛋白質結構一直和其功能有密切的聯繫。因此,科學家希望通過解析蛋白質結構,找出與Cas9融合的蛋白為何會產生脫靶效應,以及如何優化。“作為一個結構生物學家,我真的想看清一個分子並思考如何合理地改進它。” 共同第一作者Gavin Knott博士說道。

  在最新的這篇《科學》論文中,研究人員利用冷凍電鏡技術(cryoEM),以3.2埃的解像度解析了ABE8e結合DNA時的3D結構。

  “雖然堿基編輯器現在被廣泛應用於生物體,從細菌到植物再到靈長動物,進行精確修飾,但目前為止還沒有人觀察到堿基編輯器的三維分子結構,”劉如謙教授說,“這個合作項目揭示了一個美麗的分子結構:先進的、高度活躍的堿基編輯器ABE8e在與目標DNA位點接觸時被捕獲的瞬間。”

堿基編輯器的三維分子結構示意圖:結合在目標DNA(青色和藍色雙螺旋)上的Cas9蛋白(白色和灰色)與脫氨酶(紅色和粉色)把一個核苷酸轉換成另一個( 圖片來源:參考資料[2];Credit:UC Berkeley,Gavin Knott)
堿基編輯器的三維分子結構示意圖:結合在目標DNA(青色和藍色雙螺旋)上的Cas9蛋白(白色和灰色)與脫氨酶(紅色和粉色)把一個核苷酸轉換成另一個( 圖片來源:參考資料[2];Credit:UC Berkeley,Gavin Knott)

  “這讓我們第一次看到,堿基編輯器以兩個獨立模塊進行工作:Cas9模塊提供特異性,還有一個催化模塊提供活性。” 論文的共同第一作者Audrone Lapinaite博士描述道。

  結構學數據與酶活檢測揭示了ABE8e容易產生脫靶的原因。原來,連接在Cas9上的脫氨酶始終處於激活狀態。Cas9在細胞中找到預定目標之前,會不斷結合併釋放成百數千個DNA片段。換言之,始終處於激活狀態的脫氨酶讓Cas9變成一門容易走火的大炮,不等Cas9完全匹配到目標,就直接開炮。

  這一結果為科學家們重新設計與堿基編輯器帶來了新的洞見。“如果想設計真正的特異性融合蛋白,必須找到一種方法使其催化結構域完全成為Cas9的一部分,這樣才不會一直處於活躍狀態,而是只有在Cas9正確結合到目標後才被激活。” Lapinaite博士說。

  此外,ABE8e的結構數據還闡明了新版本堿基編輯器速度更快的秘訣。研究人員發現,相比早期版本,新版本上有兩個點突變,可以使蛋白質更緊密地抓住DNA,從而更有效地把A替換為G。

  “這種結構和相應的生物化學讓人興奮。我們現在可以對這個系統在細胞中的表現作出理性的預測。”Knott博士補充道。

  研究人員指出,這項新研究展示了Cas9融合蛋白的首個結構,因此其結果將為眾多從Cas9衍生的基因編輯工具提供設計指導,有助於帶來更方便、更可控、更有臨床應用價值的基因編輯工具。我們期待進一步改良的堿基編輯系統,可以在不遠的將來為遺傳病患者帶來治療希望。

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